概括：这道题是贲吐肺同学的课后生物练习题，主要是关于荧光定量pcr，指导老师为敖老师。实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

题目：荧光定量pcr

解：

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（sybr green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.但是如果要发表比较高档次的论文的话,某些变态的老外审稿并不认可单一的荧光定量PCR的结果,他们会同时需要作者做一个半定量RT-PCR来作为辅助证明.

半定量RT-PCR的引物和荧光定量PCR的引物设计原则并不是一样的,换而言之,二者的引物并不是可以通用的.所以退火温度自然是不同的,具体怎么不同,要根据实际用到的引物去算.

举一反三

例1： 实时荧光定量pcr数据如何统计?近日做实时荧光定量pcr,得到了不同的ct值,只是计算了△△ct以及2-△△ct的值,但是我不知道如何使用spss进行统计分析,看到别人的文章都是均数±标准差的形式,[数学练习题]

思路提示：

首先你这样做出来的统计没有意义.

应该是至少3次独立实验,而不是重复3次PCR.

如果3次试验,每次重复3次（取平均值算一次）.然后先定各个基因在对照组的值为一,再算出其他组该基因的相对量,比如内参CT值一样（都是15）,而TNF的CT值对照组是20,而模型组是19,则相对量是2 （对照组为1）.△△ct=（19-15）-（20-15）= -1,2-△△ ct= 2.

以此类推.

其实你只有3组,2个基因.用ANOVA先算,然后再用t test就可以了.结果表达为TNF：对照组1,模型组想x± d,药物组y± d.NF-kB:对照组1,模型组想x± d,药物组y± d.TNF和NF-kB间不需要比较.

请参考我发表的文章：

如果你提供email,我可以发全文给你.

例2： 实时荧光定量PCR注意事项

思路提示：

1.按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.开机顺序：先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件,进行实验.关机顺序：确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑.

2.应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录.同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C：/Appliedbiosystems/SDS Document.

3.良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.推荐做到以下几个方面：

电源：推荐配备合适的UPS或稳压器.

通风：仪器的通风应该没有阻挡.

温度：推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30°C之间.

湿度：20-80%；对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机.

空间：易于操作,安全.

4.怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染?怎样清除污染

一个办法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号,则表明该孔可能被荧光污染物.另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下,执行ROI的校正,当某个孔的信号明显高出其他孔时,则表明该孔被污染.

清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中.吹打数次.将废液吸入废液杯中.重复以上步骤：乙醇三次,去离子水三次.确认反应孔中的残留液体蒸发完.

例3： PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系[生物练习题]

思路提示：

你所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增

RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription）,尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR,但是我觉得这是不对的,不推荐.基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法.

实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,原理有点多,请自行百度百科,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度.

至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到.例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异

例4： 谁能具体解释一下荧光定量PCR中溶解曲线的意思以及作用?

思路提示：

用Syber Green方法做完PCR后,用来判断产物是否相对专一.反应结束后,逐渐加温.和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链,就不能在和Syber Green结合.一般每加温一度,读一次信号.当温度到达PCR产物的Tm时,产物解离一下增多.曲线的横坐标是温度,而纵坐标是荧光信号的变化!开始加热,信号变化不大,所以几乎是平的,接近Tm时,突然变化加大,所以出现峰值.再升温,产物全部解离,就又是一条直线了.

如果有非特异性产物,在加热过程中就会出现一些比较矮,宽的峰.

例5： 实时荧光定量pcr请有配过taqman探针的同学,告诉我如何从母液中配置成工作液,母液管壁标有od=2,nmoles=9.12,如何稀释母液啊[生物练习题]

思路提示：

探针附带的说明单子上有说明的 ,有说加多少灭菌水或TE可以变成100uM的母液

相关思考练习题：

题1：荧光定量PCR的操作步骤

点拨：荧光定量PCR实验步骤： ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下...

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